![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
progenesВ Каролинском институте объявлены имена лауреатов Нобелевской премии в области медицины и физиологии.
Согласно решению шведской Королевской академии наук ими стали американцы Марио Капекки (Mario R. Capecchi), Оливер Смитис (Oliver Smithies) и Мартин Эванс (Martin J. Evans) из Великобритании.
Они удостоены награды за исследования основ введения специфических генетических модификаций в организмы мышей путем использования стволовых клеток эмбрионов. В частности, речь идет о разработке способа "выключать" те или иные гены в клетках зародыша (методика получила название "генетического нокаута" - gene knockout).
Итак, что же это за gene knockout такой, за что дают Нобелевскую премию. Я хотела было посмотреть по верхам, но откровенно говоря дело непростое и запутанное, так что сама провозилась пол-утра, пока разобралась. Сейчас попробую все это показать .
На самом деле гены "выключают" давно, в основном на ощупь и разными способами. Если представить себе ДНК как клубок нити, по которой то тут, то там разбросаны "бусинки" генов (2,5%) то не так просто попать на нужный ген и выключить его. На первый взгляд вообще невозможно.
Одним из первых способов, который используется до сих пор и на котором я можно сказать собаку съела, был метод антисенс-РНК-ингибирования. Как это делается. Берется небольшая молекула ДНК, которая в дальнейшем называется вектор. Хитрость его заключается в том, что он имитирует похожую паразитную молекулу, которая существует в природе и имеет свойство сама по себе встраиваться в геном. Только в отличии от паразитной, у нее "вырваны зубы", то есть вырезаны все паразитические гены, кроме тех, которые способствуют встраиванию этой молекулы в геном (большой клубок), а вместо паразитных генов туда можно встроить какие-нибудь интересные и нужные для работы. Как правило все такие молекулы имеют ген устойчивости к какому-нибудь антибиотику для того, чтобы после встраиваниея в геном можно было лекго отобрать те клетки, которые несут вставку. Например высадить клетки на среду с этим антибиотиком: все, что не имеет вставки - подохнет, а те, у кого вставка есть и соответственно есть устойчивость к антибиотику, те выживут.
Но вернемся к антисенс-ингибированию. Если в такую молекулу (вектор) вставить ген, который мы потом хотим "вырубить" (назовем его тарджет), но не просто так, а задом наперед, а потом это все встроить в геном нормального здорового организма, то происходит вот что. В нормальном здоровом организме работает нормальный здоровый правильный ген-тарджет, продуцирую нормальную правильную РНК. Но вместе с тем наша встроенная молекула продуцирует РНК из того самого тарджета, только который, мы помним, "задом-наперед". Что происходит? Нормальная РНК и "задом-наперед" РНК встречаются в клетке и согласно комплементарности (помним, как ДНК получается двуцепочечная?) слипаются. После чего с этого слипшегося гибрида во-первых, уже никакого белка потом не считывается. Во-вторых, он часто распознается клеточными защитными системами и уничтожается. Итак ген есть, но он не работает. Чего мы не знаем, так это КУДА встроилась наша "задом-наперед" молекула. А теоретически она могла встроиться куда угодно. Например посреди какого-то другого важного гена и случайно вырубила и его. То есть мы наблюдаем эффект, но не уверены, что это результат антисенс-ингибирования или это результат случайной поломки какого-то левого гена.
Кстати, тот самый Flavr Savr томат результат такого генноинженерного подхода. У него как раз таким образом вырубили ген, кодирующий фермент полигалактуроназу (учавствует в регуляции синтеза клеточной стенки).
В последние годы с открытием точных механизмов регуляции генов (я имею в виду явнелие РНА интерференции), методика антисенс-ингибировния немного модифицировалась и улучшилась, однако место встраивания вектора все еще достаточно бесконтрольное. В этом смысле методвыколотки нок-аута является все-таки более прогрессивным. В результате этого приема "ломается" непосредственно ген и больше нечего другого. Как это придумали, ума не приложу. Метод элегантный и точный. Следите за руками.
Делается молекула- вектор (А), которая содержит ген устойчивости к антибиотику (понятно зачем, для позитивной селекции. Чтобы отобрать из всех клеток те, которые имеют вставку), затем один ген тимидин киназы (непонятно зачем, но я сообразила, для негативной селекции. Чтобы отобрать те, где вставка не там, ГДЕ НАДО). И наконец кусок гена, который мы собираемся вырубить. Кстати на картинке слегка упрощенно, без душераздирающий подробностей. Все это ограничено так называемыми короткими последовательностями Lox P из бактериофага Р1(locus of X-over P1). И весь цимес заключается в этих вставках. Потому что эти короткие вставки не что иное, как сигнал "резать тут" одному ферменту Cre. А где нам взять фермент Cre? Щас увидим. Очень просто. Есть уже готовые линие мышей, которые вырабатывают этот фермент столько, сколько надо.
Итак. Берем стволовые клетки мыши. Переносим в них вектор специальным способом. Он встраивается, в том числе и где попало. Высаживаем клетки на антибиотик. Выживают только те, кто со вставкой. Обрабатываем ферментом Cre. Ген устройчивости к антибиотику вырезается за ненадобностью , где надо. Если не вырезалось, высаживаем на среду, которая распознает тимидин киназу (я не совсем понимаю, как это происходит) и все клетки, где вставка в ненужном месте, погибают. Теперь у нас есть стволовые клетки, которые только одну аллель поломанного гена в нужном месте, органиченную Lox P. Другая, "здоровая" все еще работает. Переносим стволовые клетки в мышку (я говорила, что это не просто стволоные клетки, а бластоциты? То есть оплодотворенные якцеклетки) , мышка дает потомство, где есть процент мышек со вставкой. Теперь скрещиваем их с дрйгой готовой линией мышей, который вырабатывает фермент Cre. Вуаля. Нобелевка в кармане.
Коротко: есть способ целенаправленного выключения одного единственного гена. Любого. Для этого нужны стволовые клетки.
Для справки: Себестоимость нок-аут линии мышей сейчас 10 тыщ долларов. В ближайшем будущем ожидается удешевление до 200 долларов.
Перспективы: что можно делать с мышами, то можно делать и с не мышами. Например у родителей есть "болезнетворный раковый ген". И у потомства он соответственно будет. Но его можно "выключить", не так ли?
Согласно решению шведской Королевской академии наук ими стали американцы Марио Капекки (Mario R. Capecchi), Оливер Смитис (Oliver Smithies) и Мартин Эванс (Martin J. Evans) из Великобритании.
Они удостоены награды за исследования основ введения специфических генетических модификаций в организмы мышей путем использования стволовых клеток эмбрионов. В частности, речь идет о разработке способа "выключать" те или иные гены в клетках зародыша (методика получила название "генетического нокаута" - gene knockout).
Итак, что же это за gene knockout такой, за что дают Нобелевскую премию. Я хотела было посмотреть по верхам, но откровенно говоря дело непростое и запутанное, так что сама провозилась пол-утра, пока разобралась. Сейчас попробую все это показать .
На самом деле гены "выключают" давно, в основном на ощупь и разными способами. Если представить себе ДНК как клубок нити, по которой то тут, то там разбросаны "бусинки" генов (2,5%) то не так просто попать на нужный ген и выключить его. На первый взгляд вообще невозможно.
Одним из первых способов, который используется до сих пор и на котором я можно сказать собаку съела, был метод антисенс-РНК-ингибирования. Как это делается. Берется небольшая молекула ДНК, которая в дальнейшем называется вектор. Хитрость его заключается в том, что он имитирует похожую паразитную молекулу, которая существует в природе и имеет свойство сама по себе встраиваться в геном. Только в отличии от паразитной, у нее "вырваны зубы", то есть вырезаны все паразитические гены, кроме тех, которые способствуют встраиванию этой молекулы в геном (большой клубок), а вместо паразитных генов туда можно встроить какие-нибудь интересные и нужные для работы. Как правило все такие молекулы имеют ген устойчивости к какому-нибудь антибиотику для того, чтобы после встраиваниея в геном можно было лекго отобрать те клетки, которые несут вставку. Например высадить клетки на среду с этим антибиотиком: все, что не имеет вставки - подохнет, а те, у кого вставка есть и соответственно есть устойчивость к антибиотику, те выживут.
Но вернемся к антисенс-ингибированию. Если в такую молекулу (вектор) вставить ген, который мы потом хотим "вырубить" (назовем его тарджет), но не просто так, а задом наперед, а потом это все встроить в геном нормального здорового организма, то происходит вот что. В нормальном здоровом организме работает нормальный здоровый правильный ген-тарджет, продуцирую нормальную правильную РНК. Но вместе с тем наша встроенная молекула продуцирует РНК из того самого тарджета, только который, мы помним, "задом-наперед". Что происходит? Нормальная РНК и "задом-наперед" РНК встречаются в клетке и согласно комплементарности (помним, как ДНК получается двуцепочечная?) слипаются. После чего с этого слипшегося гибрида во-первых, уже никакого белка потом не считывается. Во-вторых, он часто распознается клеточными защитными системами и уничтожается. Итак ген есть, но он не работает. Чего мы не знаем, так это КУДА встроилась наша "задом-наперед" молекула. А теоретически она могла встроиться куда угодно. Например посреди какого-то другого важного гена и случайно вырубила и его. То есть мы наблюдаем эффект, но не уверены, что это результат антисенс-ингибирования или это результат случайной поломки какого-то левого гена.
Кстати, тот самый Flavr Savr томат результат такого генноинженерного подхода. У него как раз таким образом вырубили ген, кодирующий фермент полигалактуроназу (учавствует в регуляции синтеза клеточной стенки).
В последние годы с открытием точных механизмов регуляции генов (я имею в виду явнелие РНА интерференции), методика антисенс-ингибировния немного модифицировалась и улучшилась, однако место встраивания вектора все еще достаточно бесконтрольное. В этом смысле метод
Делается молекула- вектор (А), которая содержит ген устойчивости к антибиотику (понятно зачем, для позитивной селекции. Чтобы отобрать из всех клеток те, которые имеют вставку), затем один ген тимидин киназы (непонятно зачем, но я сообразила, для негативной селекции. Чтобы отобрать те, где вставка не там, ГДЕ НАДО). И наконец кусок гена, который мы собираемся вырубить. Кстати на картинке слегка упрощенно, без душераздирающий подробностей. Все это ограничено так называемыми короткими последовательностями Lox P из бактериофага Р1(locus of X-over P1). И весь цимес заключается в этих вставках. Потому что эти короткие вставки не что иное, как сигнал "резать тут" одному ферменту Cre. А где нам взять фермент Cre? Щас увидим. Очень просто. Есть уже готовые линие мышей, которые вырабатывают этот фермент столько, сколько надо.
Итак. Берем стволовые клетки мыши. Переносим в них вектор специальным способом. Он встраивается, в том числе и где попало. Высаживаем клетки на антибиотик. Выживают только те, кто со вставкой. Обрабатываем ферментом Cre. Ген устройчивости к антибиотику вырезается за ненадобностью , где надо. Если не вырезалось, высаживаем на среду, которая распознает тимидин киназу (я не совсем понимаю, как это происходит) и все клетки, где вставка в ненужном месте, погибают. Теперь у нас есть стволовые клетки, которые только одну аллель поломанного гена в нужном месте, органиченную Lox P. Другая, "здоровая" все еще работает. Переносим стволовые клетки в мышку (я говорила, что это не просто стволоные клетки, а бластоциты? То есть оплодотворенные якцеклетки) , мышка дает потомство, где есть процент мышек со вставкой. Теперь скрещиваем их с дрйгой готовой линией мышей, который вырабатывает фермент Cre. Вуаля. Нобелевка в кармане.
Коротко: есть способ целенаправленного выключения одного единственного гена. Любого. Для этого нужны стволовые клетки.
Для справки: Себестоимость нок-аут линии мышей сейчас 10 тыщ долларов. В ближайшем будущем ожидается удешевление до 200 долларов.
Перспективы: что можно делать с мышами, то можно делать и с не мышами. Например у родителей есть "болезнетворный раковый ген". И у потомства он соответственно будет. Но его можно "выключить", не так ли?
Tags:
