![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
progenesОбрабатываю результаты, совершенно не соображаю, как мне посчитать достоверность хотя бы приблизительно. Случай нетривиальный, требуется помощь зала в подсчете дельтадельтаСт в qRT-PCR.
Под кат смотреть тем, кто считает себя хорошим математиком и может дать совет. Остальным будет неинтересно.
1. Итак, прибор фиксирует определенное значение. Оно означает, что в момент фикисрования значения (цикла) количество продукта в реакции удваивается. Значение называется Ст.
2. Эти значения колеблются от 18 до 30. То есть все, что я меряю, имеет значения в разумных пределах, например 20.2, 18.6, 27.1, 21.3 и так далее. Это установлено параметрами реакции. Одновременно фиксируется 200 таких значений. Одно из этих значений - контроль и равен он 21 (назовем его ген К).
3. Дальше я пляшу от этого контроля и считаю дельта Ст. Например, одно из 200сот значений, назовем его ген А 22, 5, значит 22,5- 21= 1,5
4. Поскольку продукт удваивается, то эта разница означает, что у меня исходного продукта было 2,25 раз меньше (таковы условия игры). То есть разница в дельта Ст в одну единицу означает удвоенную разницу в продукте по принципу геометрической прогрессии. Если дельта СТ равна 3, то соответственно разница в 9 и так далее.
5. Если одно из 200 значений меньше 21 (контроля), например, 20.3 (назовем его ген Б), то у меня дельтаСт имеет минусовое значение. 20.3-21=-0.7 Это для меня большого значения не имеет. Это говорит только о том, что у меня исходного продукта было в 0.49 раз больше.
6. Этот контроль ген К у меня используется исключительно для нормализации результатов. Потому что в следующем измерении я повторяю реакцию для 200 значения при новых условиях. Контроль для нормализации остается прежним. Только вышеупомянутый ген А при новых условиях показывает значение не 22.5, а скажем, 24.1. А ген Б вместо 20.3 показывает 20.0.
7. Таким образом для гена А и Б я первым делом провожу нормализацию против контроля :
Сырые данные:
Эксперимент 1
ген А 22.5
ген Б 20.3
ген К 21.0
Эксперимент 2
ген А 24.1
ген Б 20.0
ген К 21.0
Нормализованные данные (дельта Ст):
Эксперимент 1
ген А 1.5
ген Б -0.7
Эксперимент 2
ген А 3.1
ген Б -1
8. Теперь я сравниваю дельта Ст для гена А и Б в разных экспериментах. Это называется дельта-дельта Ст.
Ген А 1.5-3.1= -1.6
Ген Б -0.7 +1 = 0.3
7. Как я выше уже сказала, изменение на одну единицу обозначает разницу в исходном продукте в два раза. Разницу я считаю как
Ratio = 2^-дельта дельта Ст. Итого,
Ген А =2^-(-1.6)=3.03
Ген Б =2^-(0.3)=0.8
8. До этого момент мне все ясно. Теперь начинается статистика. Я повторяю все измерения скажем дважды. Любой биолог, скажет, что с двумя повторами никакой статистики не сделаешь. Но тут есть нюансы. Метод достаточно надежный, с внутренним контролем (ген К), довольно чувствительный и дорогой. Я посмотрела публикации и вижу, что народ умудряется публиковать вообще с одним измерением без повтором. Валидируют один раз метод и больше валидирование не повторяют. Но я повторила это все дважды. Это мало для того, чтобы делать ттест и считать Р-value.
9. Поэтому максимум считают coefficient of variation. И тут у меня полный ступор. Если считать coefficient of variation для трех сырых значений трех измерений скажем гена М, например, 22.1 22.0 22.3 то у нас получается чудесное значение CV 0.56% . А если считать coefficient of variation для дельта СТ 1.10 1 1.3, то получается уже 11% !
Еще хуже, если значения для гена С 21.1 21.0 21.3 то для сырых значений CV 0.59%, а для нормализованых против котроля значений 0.1 0 0.3 CV будет показывать безобразные 93%!!! А ведь реальная разница одна и та же.
10. Че делать?
11. UPD Я не одна такая дура и это радует. 12. UPD2. Болельщикам и помощникам. Спасибо за ответы и советы и нужные вопросы. Я пока все еще не разобралась, как мне считать вариабельность, но наверное буду делать так, тем более есть на что ссылаться: "To analyse gene profiles between the two biological replicates, a one-way ANOVA (P < 0.05), using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK), was performed on each TF. In order to calculate relative TF expression levels, the efficiency values of each amplification reaction were taken into account using LinReg software. Amplification reactions of efficiencies lower than 1.6 were considered as missing data. Differences in transcript abundance during seed developmental stages were also evaluated by a one-way ANOVA test (P < 0.05) and a Student–Newman–Keuls test for each TFs using SAS software package (SAS Institute 1999). To compare expression profiles, expression values were adjusted by a normal distribution." Осталось узнать, чем отличается one-way ANOVA от two-way ANOVA, как это все отличается от банального ттеста и что такое Student–Newman–Keuls test.
Под кат смотреть тем, кто считает себя хорошим математиком и может дать совет. Остальным будет неинтересно.
1. Итак, прибор фиксирует определенное значение. Оно означает, что в момент фикисрования значения (цикла) количество продукта в реакции удваивается. Значение называется Ст.
2. Эти значения колеблются от 18 до 30. То есть все, что я меряю, имеет значения в разумных пределах, например 20.2, 18.6, 27.1, 21.3 и так далее. Это установлено параметрами реакции. Одновременно фиксируется 200 таких значений. Одно из этих значений - контроль и равен он 21 (назовем его ген К).
3. Дальше я пляшу от этого контроля и считаю дельта Ст. Например, одно из 200сот значений, назовем его ген А 22, 5, значит 22,5- 21= 1,5
4. Поскольку продукт удваивается, то эта разница означает, что у меня исходного продукта было 2,25 раз меньше (таковы условия игры). То есть разница в дельта Ст в одну единицу означает удвоенную разницу в продукте по принципу геометрической прогрессии. Если дельта СТ равна 3, то соответственно разница в 9 и так далее.
5. Если одно из 200 значений меньше 21 (контроля), например, 20.3 (назовем его ген Б), то у меня дельтаСт имеет минусовое значение. 20.3-21=-0.7 Это для меня большого значения не имеет. Это говорит только о том, что у меня исходного продукта было в 0.49 раз больше.
6. Этот контроль ген К у меня используется исключительно для нормализации результатов. Потому что в следующем измерении я повторяю реакцию для 200 значения при новых условиях. Контроль для нормализации остается прежним. Только вышеупомянутый ген А при новых условиях показывает значение не 22.5, а скажем, 24.1. А ген Б вместо 20.3 показывает 20.0.
7. Таким образом для гена А и Б я первым делом провожу нормализацию против контроля :
Сырые данные:
Эксперимент 1
ген А 22.5
ген Б 20.3
ген К 21.0
Эксперимент 2
ген А 24.1
ген Б 20.0
ген К 21.0
Нормализованные данные (дельта Ст):
Эксперимент 1
ген А 1.5
ген Б -0.7
Эксперимент 2
ген А 3.1
ген Б -1
8. Теперь я сравниваю дельта Ст для гена А и Б в разных экспериментах. Это называется дельта-дельта Ст.
Ген А 1.5-3.1= -1.6
Ген Б -0.7 +1 = 0.3
7. Как я выше уже сказала, изменение на одну единицу обозначает разницу в исходном продукте в два раза. Разницу я считаю как
Ratio = 2^-дельта дельта Ст. Итого,
Ген А =2^-(-1.6)=3.03
Ген Б =2^-(0.3)=0.8
8. До этого момент мне все ясно. Теперь начинается статистика. Я повторяю все измерения скажем дважды. Любой биолог, скажет, что с двумя повторами никакой статистики не сделаешь. Но тут есть нюансы. Метод достаточно надежный, с внутренним контролем (ген К), довольно чувствительный и дорогой. Я посмотрела публикации и вижу, что народ умудряется публиковать вообще с одним измерением без повтором. Валидируют один раз метод и больше валидирование не повторяют. Но я повторила это все дважды. Это мало для того, чтобы делать ттест и считать Р-value.
9. Поэтому максимум считают coefficient of variation. И тут у меня полный ступор. Если считать coefficient of variation для трех сырых значений трех измерений скажем гена М, например, 22.1 22.0 22.3 то у нас получается чудесное значение CV 0.56% . А если считать coefficient of variation для дельта СТ 1.10 1 1.3, то получается уже 11% !
Еще хуже, если значения для гена С 21.1 21.0 21.3 то для сырых значений CV 0.59%, а для нормализованых против котроля значений 0.1 0 0.3 CV будет показывать безобразные 93%!!! А ведь реальная разница одна и та же.
10. Че делать?
11. UPD Я не одна такая дура и это радует. 12. UPD2. Болельщикам и помощникам. Спасибо за ответы и советы и нужные вопросы. Я пока все еще не разобралась, как мне считать вариабельность, но наверное буду делать так, тем более есть на что ссылаться: "To analyse gene profiles between the two biological replicates, a one-way ANOVA (P < 0.05), using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK), was performed on each TF. In order to calculate relative TF expression levels, the efficiency values of each amplification reaction were taken into account using LinReg software. Amplification reactions of efficiencies lower than 1.6 were considered as missing data. Differences in transcript abundance during seed developmental stages were also evaluated by a one-way ANOVA test (P < 0.05) and a Student–Newman–Keuls test for each TFs using SAS software package (SAS Institute 1999). To compare expression profiles, expression values were adjusted by a normal distribution." Осталось узнать, чем отличается one-way ANOVA от two-way ANOVA, как это все отличается от банального ттеста и что такое Student–Newman–Keuls test.
no subject
Date: 2009-03-10 04:33 pm (UTC)Дело в том, что если кДНК не сажать и брать по 3-5 мкл на ПЦР, то эффективность выходит сильно отличающаяся от стандартов кои изготвлены из плазмид и т. п.
Я много "экспериментировал" в этом плане и выяснил :-) что единственный достоверный способ убедиться в равной эффективности разных ПЦР это делать раститровки кДНК. Скажем, три последовательных разведения и каждое в дубле. 6 пробирок на таргет. :-(
Ну и конечно, практически не возможно увидить разницу в 30-50%
Считаю обоснованным обычное усереднение по нескольким экспериментам.
Vlad
no subject
Date: 2009-03-11 07:11 am (UTC)Кроме того, я сравниваю стадии развития одной ткани с шагом в два дня. Между двумя близлежащими стадиями нет и не может быть разницы в экспрессии генов большей, чем в 2 раза. Экспрессия меняется плавно. Например постадийно 29,12684491 27,87551706 27,0992972 26,6001584 25,90098901 25,74610014 Я, лично, отчетливо вижу профиль экпрессии.
Или вот обратный профиль 16,84324709 17,89854062 19,1459743 20,68447836 21,16253163
Более того, Это экспрессия факторов транскрипции. Они в основном в данной ткани в этой культуре экспрессируются довольно слабо. Есть три фактора, экспрессию которых можно зафиксировать на нозерне. Поэтому ПЦР был выбран как чувствительная альтернатива.
no subject
Date: 2009-03-11 03:11 pm (UTC)(и вообще я не писатель :-) )
На счёт бюджета и прочих возможностей я всё понимаю.
Касательно эффективности ПЦР, как краеугольного камня, много информации тут:
http://www.gene-quantification.de/ в разделе „Determination of PCR Efficiency”
Но всё это важно (особенно важно) если копийность (референс/таргет) сильно отличается. Если же отличие небольшое (2-4 цикла) то даже при сильно различающейся эффективности большая ошибка не набежит.
Что же касается «разрешения» QPCR, то это легко проверяется. Берётся плазмида (стандарт) и раскапывается серия разведений, скажем так: х1.0; х1.25; х1.5; х1.75; х2.0 и проверяется. Желательно делать чётное число дублей :-)
Я проверял.
Вот кстати, вы в белых плашках работаете? Белые сильно лучше прозрачных (на BioRad-е)
Vlad
no subject
Date: 2009-03-11 03:35 pm (UTC)no subject
Date: 2009-03-11 03:35 pm (UTC)