![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
progenesОбрабатываю результаты, совершенно не соображаю, как мне посчитать достоверность хотя бы приблизительно. Случай нетривиальный, требуется помощь зала в подсчете дельтадельтаСт в qRT-PCR.
Под кат смотреть тем, кто считает себя хорошим математиком и может дать совет. Остальным будет неинтересно.
1. Итак, прибор фиксирует определенное значение. Оно означает, что в момент фикисрования значения (цикла) количество продукта в реакции удваивается. Значение называется Ст.
2. Эти значения колеблются от 18 до 30. То есть все, что я меряю, имеет значения в разумных пределах, например 20.2, 18.6, 27.1, 21.3 и так далее. Это установлено параметрами реакции. Одновременно фиксируется 200 таких значений. Одно из этих значений - контроль и равен он 21 (назовем его ген К).
3. Дальше я пляшу от этого контроля и считаю дельта Ст. Например, одно из 200сот значений, назовем его ген А 22, 5, значит 22,5- 21= 1,5
4. Поскольку продукт удваивается, то эта разница означает, что у меня исходного продукта было 2,25 раз меньше (таковы условия игры). То есть разница в дельта Ст в одну единицу означает удвоенную разницу в продукте по принципу геометрической прогрессии. Если дельта СТ равна 3, то соответственно разница в 9 и так далее.
5. Если одно из 200 значений меньше 21 (контроля), например, 20.3 (назовем его ген Б), то у меня дельтаСт имеет минусовое значение. 20.3-21=-0.7 Это для меня большого значения не имеет. Это говорит только о том, что у меня исходного продукта было в 0.49 раз больше.
6. Этот контроль ген К у меня используется исключительно для нормализации результатов. Потому что в следующем измерении я повторяю реакцию для 200 значения при новых условиях. Контроль для нормализации остается прежним. Только вышеупомянутый ген А при новых условиях показывает значение не 22.5, а скажем, 24.1. А ген Б вместо 20.3 показывает 20.0.
7. Таким образом для гена А и Б я первым делом провожу нормализацию против контроля :
Сырые данные:
Эксперимент 1
ген А 22.5
ген Б 20.3
ген К 21.0
Эксперимент 2
ген А 24.1
ген Б 20.0
ген К 21.0
Нормализованные данные (дельта Ст):
Эксперимент 1
ген А 1.5
ген Б -0.7
Эксперимент 2
ген А 3.1
ген Б -1
8. Теперь я сравниваю дельта Ст для гена А и Б в разных экспериментах. Это называется дельта-дельта Ст.
Ген А 1.5-3.1= -1.6
Ген Б -0.7 +1 = 0.3
7. Как я выше уже сказала, изменение на одну единицу обозначает разницу в исходном продукте в два раза. Разницу я считаю как
Ratio = 2^-дельта дельта Ст. Итого,
Ген А =2^-(-1.6)=3.03
Ген Б =2^-(0.3)=0.8
8. До этого момент мне все ясно. Теперь начинается статистика. Я повторяю все измерения скажем дважды. Любой биолог, скажет, что с двумя повторами никакой статистики не сделаешь. Но тут есть нюансы. Метод достаточно надежный, с внутренним контролем (ген К), довольно чувствительный и дорогой. Я посмотрела публикации и вижу, что народ умудряется публиковать вообще с одним измерением без повтором. Валидируют один раз метод и больше валидирование не повторяют. Но я повторила это все дважды. Это мало для того, чтобы делать ттест и считать Р-value.
9. Поэтому максимум считают coefficient of variation. И тут у меня полный ступор. Если считать coefficient of variation для трех сырых значений трех измерений скажем гена М, например, 22.1 22.0 22.3 то у нас получается чудесное значение CV 0.56% . А если считать coefficient of variation для дельта СТ 1.10 1 1.3, то получается уже 11% !
Еще хуже, если значения для гена С 21.1 21.0 21.3 то для сырых значений CV 0.59%, а для нормализованых против котроля значений 0.1 0 0.3 CV будет показывать безобразные 93%!!! А ведь реальная разница одна и та же.
10. Че делать?
11. UPD Я не одна такая дура и это радует. 12. UPD2. Болельщикам и помощникам. Спасибо за ответы и советы и нужные вопросы. Я пока все еще не разобралась, как мне считать вариабельность, но наверное буду делать так, тем более есть на что ссылаться: "To analyse gene profiles between the two biological replicates, a one-way ANOVA (P < 0.05), using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK), was performed on each TF. In order to calculate relative TF expression levels, the efficiency values of each amplification reaction were taken into account using LinReg software. Amplification reactions of efficiencies lower than 1.6 were considered as missing data. Differences in transcript abundance during seed developmental stages were also evaluated by a one-way ANOVA test (P < 0.05) and a Student–Newman–Keuls test for each TFs using SAS software package (SAS Institute 1999). To compare expression profiles, expression values were adjusted by a normal distribution." Осталось узнать, чем отличается one-way ANOVA от two-way ANOVA, как это все отличается от банального ттеста и что такое Student–Newman–Keuls test.
Под кат смотреть тем, кто считает себя хорошим математиком и может дать совет. Остальным будет неинтересно.
1. Итак, прибор фиксирует определенное значение. Оно означает, что в момент фикисрования значения (цикла) количество продукта в реакции удваивается. Значение называется Ст.
2. Эти значения колеблются от 18 до 30. То есть все, что я меряю, имеет значения в разумных пределах, например 20.2, 18.6, 27.1, 21.3 и так далее. Это установлено параметрами реакции. Одновременно фиксируется 200 таких значений. Одно из этих значений - контроль и равен он 21 (назовем его ген К).
3. Дальше я пляшу от этого контроля и считаю дельта Ст. Например, одно из 200сот значений, назовем его ген А 22, 5, значит 22,5- 21= 1,5
4. Поскольку продукт удваивается, то эта разница означает, что у меня исходного продукта было 2,25 раз меньше (таковы условия игры). То есть разница в дельта Ст в одну единицу означает удвоенную разницу в продукте по принципу геометрической прогрессии. Если дельта СТ равна 3, то соответственно разница в 9 и так далее.
5. Если одно из 200 значений меньше 21 (контроля), например, 20.3 (назовем его ген Б), то у меня дельтаСт имеет минусовое значение. 20.3-21=-0.7 Это для меня большого значения не имеет. Это говорит только о том, что у меня исходного продукта было в 0.49 раз больше.
6. Этот контроль ген К у меня используется исключительно для нормализации результатов. Потому что в следующем измерении я повторяю реакцию для 200 значения при новых условиях. Контроль для нормализации остается прежним. Только вышеупомянутый ген А при новых условиях показывает значение не 22.5, а скажем, 24.1. А ген Б вместо 20.3 показывает 20.0.
7. Таким образом для гена А и Б я первым делом провожу нормализацию против контроля :
Сырые данные:
Эксперимент 1
ген А 22.5
ген Б 20.3
ген К 21.0
Эксперимент 2
ген А 24.1
ген Б 20.0
ген К 21.0
Нормализованные данные (дельта Ст):
Эксперимент 1
ген А 1.5
ген Б -0.7
Эксперимент 2
ген А 3.1
ген Б -1
8. Теперь я сравниваю дельта Ст для гена А и Б в разных экспериментах. Это называется дельта-дельта Ст.
Ген А 1.5-3.1= -1.6
Ген Б -0.7 +1 = 0.3
7. Как я выше уже сказала, изменение на одну единицу обозначает разницу в исходном продукте в два раза. Разницу я считаю как
Ratio = 2^-дельта дельта Ст. Итого,
Ген А =2^-(-1.6)=3.03
Ген Б =2^-(0.3)=0.8
8. До этого момент мне все ясно. Теперь начинается статистика. Я повторяю все измерения скажем дважды. Любой биолог, скажет, что с двумя повторами никакой статистики не сделаешь. Но тут есть нюансы. Метод достаточно надежный, с внутренним контролем (ген К), довольно чувствительный и дорогой. Я посмотрела публикации и вижу, что народ умудряется публиковать вообще с одним измерением без повтором. Валидируют один раз метод и больше валидирование не повторяют. Но я повторила это все дважды. Это мало для того, чтобы делать ттест и считать Р-value.
9. Поэтому максимум считают coefficient of variation. И тут у меня полный ступор. Если считать coefficient of variation для трех сырых значений трех измерений скажем гена М, например, 22.1 22.0 22.3 то у нас получается чудесное значение CV 0.56% . А если считать coefficient of variation для дельта СТ 1.10 1 1.3, то получается уже 11% !
Еще хуже, если значения для гена С 21.1 21.0 21.3 то для сырых значений CV 0.59%, а для нормализованых против котроля значений 0.1 0 0.3 CV будет показывать безобразные 93%!!! А ведь реальная разница одна и та же.
10. Че делать?
11. UPD Я не одна такая дура и это радует. 12. UPD2. Болельщикам и помощникам. Спасибо за ответы и советы и нужные вопросы. Я пока все еще не разобралась, как мне считать вариабельность, но наверное буду делать так, тем более есть на что ссылаться: "To analyse gene profiles between the two biological replicates, a one-way ANOVA (P < 0.05), using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK), was performed on each TF. In order to calculate relative TF expression levels, the efficiency values of each amplification reaction were taken into account using LinReg software. Amplification reactions of efficiencies lower than 1.6 were considered as missing data. Differences in transcript abundance during seed developmental stages were also evaluated by a one-way ANOVA test (P < 0.05) and a Student–Newman–Keuls test for each TFs using SAS software package (SAS Institute 1999). To compare expression profiles, expression values were adjusted by a normal distribution." Осталось узнать, чем отличается one-way ANOVA от two-way ANOVA, как это все отличается от банального ттеста и что такое Student–Newman–Keuls test.
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
Да еще вопрос.
Date: 2009-03-11 04:38 pm (UTC)первый СТ контроля связан с первым СТ гена Х (типа одно выделение, реверсия, ПЦР в одной пробирке по разным каналам) - верно?
А второй СТ контроля связан со вторым СТ гена Х, так?
а вот
В первый день (например)
Первый СТ гена Х дикого как-то связан с Первым СТ гена Х трансгена (типа одно выделение, реверсия) ?
А второй соответственно со вторым?
Или их порядок условен? Что 21 и 22 для СТ гена Х дикого, что 22 и 21 для СТ гена Х дикого - одно и то же?
Re: Да еще вопрос.
Date: 2009-03-11 04:44 pm (UTC)Более того, я сравнивала абсолютные значения контроля в другом выделении и даже на другом сорте и другом трансгене но на той же ткани. Так вот, он практически не меняется, такая я аккуратная :-) Я контроли долго и тщательно подбирала, потому что стандарные актины нам не подходят - зависят от развития.
Re: Да еще вопрос.
Date: 2009-03-11 04:53 pm (UTC)День 1 измер1 Дикий = 22 Трансген = 23
День 2 измер 2 Дикий = 23 Трансген = 24
Это полностью эквивалентно
День 1 измер1 Дикий = 23 Трансген = 23
День 2 измер 2 Дикий = 22 Трансген = 24 ??
Первое измерение дикого и трансгена в одной пробирке идет?
А второе измерение дикого и трансгена в другой, соседней пробирке идет?
Или Первое измерение дикого и трансгена в одном ПЦР прогоне в разных, соседних пробирках идет?
А второе измерение дикого и трансгена одном, следующем ПЦР прогоне в разных, соседних пробирках идет?
Или они УСЛОВНО пронумерованы как первое и второе?
Re: Да еще вопрос.
Date: 2009-03-11 05:01 pm (UTC)Итак. Один прогон - это одна плашка приблизительно с 120 парами праймеров в отдельных ячейках. На всю плашку (в каждую ячейку) наношу один и тот самый темплейт кДНК из одного дня из одного растения. Другую кДНК на одну и ту же плашку не наношу.
Следующий прогон - следующая кДНК из биологического повтора из того же дня с теми же праймерами. Следующий прогон - кДНК следующего дня. И так далее.
Теперь дурацкий вопрос
Date: 2009-03-11 05:09 pm (UTC)Просто измеряются разными праймерами?
Или дикий и трансген из разных растений и попадают на разные плашки?
Re: Теперь дурацкий вопрос
Date: 2009-03-11 05:14 pm (UTC)Я готова с таблицей и высылаю. Для чистоты эксперимента я вообще ничего не меняла, только выбросила значения, где ПЦР ничего не фиксировал. Это нефильтрованные данные и есть гены, которые не показывают никаких различий ни в профилях, ни в между трансгенным растением и диким типом.
Re: Теперь дурацкий вопрос
Date: 2009-03-11 05:25 pm (UTC)Re: Теперь дурацкий вопрос
Date: 2009-03-11 05:31 pm (UTC)но пока не получил.
Re: Пока не получил.
Date: 2009-03-11 05:43 pm (UTC)Теперь со всех получил.
Date: 2009-03-11 05:54 pm (UTC)Разное кол-во кДНК раскапывали?
Генов много, вряд ли буду сразу все смотреть.
Назовите пяток самых интересных и где есть подозрение на наличие эффекта.
Ухожу, остальное потом.
Re: Теперь со всех получил.
Date: 2009-03-11 07:20 pm (UTC)