![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
progenesПолимеразная цепная реакция (ПЦР) - это альфа и омега молекулярной биологии. Если бы не этот метод, то ничего бы мы не знали про гены толком, не могли бы их клонировать нормально и вообще, читаешь "молекулярная биология", понимаешь ПЦР.
С помощью ПЦР диагностируют наследственные и вирусные заболевания, в криминологии именно этот метод лежит в основе «генетических отпечатков пальцев» и определении отцовства, также с его помощью клонируют гены и секвенируют (читают) ДНК, а также определяют наличие генномодифицированных продуктов в супермаркете. В общем как мы видим метод нужный, полезный и шорокораспространенный. И главное, простой до безобразия. Так что теперь решайте сами, хотите ли вы об этом знать или .
Немного теории: ПЦР - это просто физическое копирование какого-либо куска ДНК. В основе метода лежит свойство одного фермента, который называется ДНК полимераза, синтезировать новый такой же кусок ДНК на уже имеющейся ДНК-матрице. ДНК-матрица может быть просто любая геномная ДНК, но какой именно кусок мы будем копировать, определяют затравки, о которых чуть ниже.
Сначала сделать так, чтобы ДНК-матрица расплелась и разъеденилась на отдельные цепи (мы помним, что это двойная спираль). Это делается простым нагреванием до 95°C на 30 секунд.
ДНК полимеразе для начала синтеза надо затравку, чтобы за что-то уцепиться. Такие затравки называются праймеры. Фактически это и есть главное в реакции. Праймеры должны сесть комплементарно на ДНК-матрицу с обеих сторон куска ДНК, которого мы хотим накопировать (амплифицировать). Поэтому для выбора праймеров мы должны уже знать все про кусок, который мы копируем (то есть его нуклеотидную последовательность). Праймеры обычно небольшие, по 20 нуклеотидов и одноцепочечные. Чтобы праймеры сели на раскрученную ДНК, температуру реакции понижаем градусов до 55° тоже на 30 секунд.
После того, как праймеры сели на ДНК-матрицу, поднимаем температуру до 72 °C и тут в работу вступает ДНК полимераза и синтезирует новую цепь. Для этого ей пожалуй достаточно одной минуты. Готово. У нас была одна двуспиральная нить ДНК, теперь у нас две точно такие же.
Дальше делаем вот что. Просто повторяем этот цикл еще раз. В результате из двух нитей ДНК у нас получается уже четыре. Теперь еще раз. Получаем восемь. Таким образом после 20 циклов у нас достаточно копий, чтобы увидеть ДНК на электрофорезе вооруженным глазом.
Чтобы красиво все себе представить я не придумала ничего лучшего, как отправить вас посмотреть красочную анимацию. На мой взгляд просто, красиво и со вкусом. Потом можно еще раз перечитать, что я тут написала.
Понятно, что постоянное повторение цикла можно попробовать как-то автоматизировать. Для этого придумали ПЦР-машины.
Выглядят они вот так:
Теперь представим, что у нас есть организм, содержащий вирус или чужеродную ДНК. Мы можем определить ее наличие, накопировав из геномной ДНК кусок, кодирующий этот самый вирус или чужеродную ДНК. Для этого достаточно выбрать соответствующие праймеры.
Итак, в пробирочку сливаем:
1. ДНК-матрицу (10 нанограмм, иногда достаточно одной молекулы) . Это может быть ваша ДНК и вашего соседа, экстракт ДНК из трансгенной сои.
2. Праймеры.
3. Нулеотиды. Это те самые строительные "кирпичи" для ДНК.
4. ДНК-полимеразу. Как правило это полимераза из термофильной бактерии, чтобы успешно переживать высокие температуры.
5. Буфер. Это фактически среда, где проходит реакция.
Пробирочки нам для этого надо будет маленькие. Потому что эта реакция проходит в каких--то 20 микролитрах.
Ставим эти пробирочки в ПЦР-машину и запускаем 20 циклов. Идем пить кофе и читать ЖЖ.
Через примерно часик идем назад в лабораторию, и все содержимое пробирок наносим на электрофоретический гель, точно так же, как мы смотрели в прошлый раз.
Включаем и опять идем пить кофе. Через некоторое время смотрим в ультрафиолете, что у нас получилось:
В некоторых пробах видно белые полосочки, это и есть ДНК, которая наамплифицировалась в результате ПЦР (понимаю, что звучит ужасно. Но это лабораторный слэнг). Она же обозначена стрелкой. Как видно, в некоторый пробах ее нет. Значить пробы не содержали соответствующей ДНК-матрицы. Это называется ПЦР-негативный результат. В диагностическом ПЦР говорит об например отсутствии вируса куриного гриппа в пробах или ГМО в продуктах.
С помощью ПЦР диагностируют наследственные и вирусные заболевания, в криминологии именно этот метод лежит в основе «генетических отпечатков пальцев» и определении отцовства, также с его помощью клонируют гены и секвенируют (читают) ДНК, а также определяют наличие генномодифицированных продуктов в супермаркете. В общем как мы видим метод нужный, полезный и шорокораспространенный. И главное, простой до безобразия. Так что теперь решайте сами, хотите ли вы об этом знать или .
Немного теории: ПЦР - это просто физическое копирование какого-либо куска ДНК. В основе метода лежит свойство одного фермента, который называется ДНК полимераза, синтезировать новый такой же кусок ДНК на уже имеющейся ДНК-матрице. ДНК-матрица может быть просто любая геномная ДНК, но какой именно кусок мы будем копировать, определяют затравки, о которых чуть ниже.
Сначала сделать так, чтобы ДНК-матрица расплелась и разъеденилась на отдельные цепи (мы помним, что это двойная спираль). Это делается простым нагреванием до 95°C на 30 секунд.
ДНК полимеразе для начала синтеза надо затравку, чтобы за что-то уцепиться. Такие затравки называются праймеры. Фактически это и есть главное в реакции. Праймеры должны сесть комплементарно на ДНК-матрицу с обеих сторон куска ДНК, которого мы хотим накопировать (амплифицировать). Поэтому для выбора праймеров мы должны уже знать все про кусок, который мы копируем (то есть его нуклеотидную последовательность). Праймеры обычно небольшие, по 20 нуклеотидов и одноцепочечные. Чтобы праймеры сели на раскрученную ДНК, температуру реакции понижаем градусов до 55° тоже на 30 секунд.
После того, как праймеры сели на ДНК-матрицу, поднимаем температуру до 72 °C и тут в работу вступает ДНК полимераза и синтезирует новую цепь. Для этого ей пожалуй достаточно одной минуты. Готово. У нас была одна двуспиральная нить ДНК, теперь у нас две точно такие же.
Дальше делаем вот что. Просто повторяем этот цикл еще раз. В результате из двух нитей ДНК у нас получается уже четыре. Теперь еще раз. Получаем восемь. Таким образом после 20 циклов у нас достаточно копий, чтобы увидеть ДНК на электрофорезе вооруженным глазом.
Чтобы красиво все себе представить я не придумала ничего лучшего, как отправить вас посмотреть красочную анимацию. На мой взгляд просто, красиво и со вкусом. Потом можно еще раз перечитать, что я тут написала.
Понятно, что постоянное повторение цикла можно попробовать как-то автоматизировать. Для этого придумали ПЦР-машины.
Выглядят они вот так:
Теперь представим, что у нас есть организм, содержащий вирус или чужеродную ДНК. Мы можем определить ее наличие, накопировав из геномной ДНК кусок, кодирующий этот самый вирус или чужеродную ДНК. Для этого достаточно выбрать соответствующие праймеры.
Итак, в пробирочку сливаем:
1. ДНК-матрицу (10 нанограмм, иногда достаточно одной молекулы) . Это может быть ваша ДНК и вашего соседа, экстракт ДНК из трансгенной сои.
2. Праймеры.
3. Нулеотиды. Это те самые строительные "кирпичи" для ДНК.
4. ДНК-полимеразу. Как правило это полимераза из термофильной бактерии, чтобы успешно переживать высокие температуры.
5. Буфер. Это фактически среда, где проходит реакция.
Пробирочки нам для этого надо будет маленькие. Потому что эта реакция проходит в каких--то 20 микролитрах.
Ставим эти пробирочки в ПЦР-машину и запускаем 20 циклов. Идем пить кофе и читать ЖЖ.
Через примерно часик идем назад в лабораторию, и все содержимое пробирок наносим на электрофоретический гель, точно так же, как мы смотрели в прошлый раз.
Включаем и опять идем пить кофе. Через некоторое время смотрим в ультрафиолете, что у нас получилось:В некоторых пробах видно белые полосочки, это и есть ДНК, которая наамплифицировалась в результате ПЦР (понимаю, что звучит ужасно. Но это лабораторный слэнг). Она же обозначена стрелкой. Как видно, в некоторый пробах ее нет. Значить пробы не содержали соответствующей ДНК-матрицы. Это называется ПЦР-негативный результат. В диагностическом ПЦР говорит об например отсутствии вируса куриного гриппа в пробах или ГМО в продуктах.
Tags:
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
no subject
Date: 2007-07-26 04:24 pm (UTC)А еще - красивая все-таки была идея. Представляешь, каково было это все делать вручную на трех водяных банях? :)))
no subject
Date: 2007-07-26 06:55 pm (UTC)no subject
Date: 2011-02-21 07:14 am (UTC)no subject
Date: 2011-02-21 07:24 am (UTC)no subject
Date: 2011-02-21 07:37 am (UTC)no subject
Date: 2011-02-21 07:41 am (UTC)no subject
Date: 2011-03-03 09:18 am (UTC)В первый раз обнаруживаю нужную по работе информацию у френдов, большое вам спасибо за эту маленькую лекцию.
По просмотру анимации процесса возник вопрос: Полимераза синтезирует ДНК начиная с праймера - это точка старт, а где точка финиш? т.е. что останавиливает процесс синтеза от того что бы не скопировать всю нить до конца?
no subject
Date: 2011-03-03 11:28 am (UTC)no subject
Date: 2011-03-03 11:33 am (UTC)no subject
Date: 2011-03-03 11:47 am (UTC)no subject
Date: 2011-03-03 12:04 pm (UTC)no subject
Date: 2011-03-03 12:11 pm (UTC)