Лабораторные суеверия, мифы и факты про РНК.

[progenes]

Прошлый пост затронул любимую тему молекулярщиков - выделение РНК. Я тут собрала наши лабораторные мифы и суеверия об РНК.

Итак, 15 РНК фактов:

1. Перед тем, как приступить к выделению РНК, надо все реактивы и инструменты проавтоклавировать и охладить. Реактивы готовить на специальной воде, которая обработана ингибиторами ферментов (DEPC), которые разрушают РНК (РНКазы). Инструменты (ступки, пробирки, носики для пипеток) также обрабатываются этой водой с DEPC перед автоклавированием (стерилизацией). Поверхность стола обрабатывается ингибиторами РНКаз - DEPC. Если есть возможность, то носики-насадки на пипетки следует брать разовые, специально предварительно обработанные на заводе ингибиторами РНКаз. Материал растирать в жидком азоте, а последующие процедуры экстракции проводить на льду. Перед выделением РНК хорошо выспаться, сверить протокол с фазами луны и выгнать из лаборатории праздношатающихся. DEPC поставить на столе для отпугивания РНКаз.

2. Выделение РНК - едва ли не единственный экспериментальный процесс, где резиновые перчатки призваны не защитить руки экспериментатора от ядовитых реактивов, а скорее РНКу от рук экспериментатора (на руках есть РНКазы). На РНКу в процессе выделения не дышать (в зловонном дыхании есть РНКазы). И не смотреть (мало ли чего).

3. У каждого экспериментатора есть свой тайный протокол выделения РНК с прописями уникальных буферов. Протокол включает минимум 10 последовательных шагов экстракции разными реактивами, не считая очистки в хлориде лития и обработки ДНКазами. У меня таких протокола три.

4. Все-равно РНК обычно валится еще до того, как сделан последний шаг в выделении - растворение осадка. Шансы на успешное выделение РНК сильно падают, если записать протокол в лабораторный журнал до того, как РНКу окончательно выделить и померять на спектрофотометре.

5. Если придерживаться всех рекомендаций и делать все процедуры очень тщательно, то в одном из образцов обязательно окажется мелкая мушка. Это будет самый важный образец. Наличие мухи на результаты не повлияет.

6. Тем не менее существует копеечный набор реактивов для выделения РНК, который состоит из всего 3х растворов: буфер для экстракции, раствор для осаждения и буфер для разведения осадка РНКи. Все процедуры проводятся при комнатной температуре на грязном столе за один час.

7. Набор снят с производства в результате заговора империалистов. Состав реактивов не знает никто.

8. Опытным путем установлено, что РНК после выделения китом фирмы QUIAGEN показывает прекрасную очистку на фотометре, чудесное качество на контрольных форезах, но отвратительную афинность при гибридизации.

9. В то же время, грязная и некачественная РНК, выделенная тайным китом из трех реактивов, дает исключительный результат во всех дальнейших процедурах.

10. Существуют колонки для очистки и концентрации РНК, но ими категорически не рекомендуется пользоваться тем, у кого отсутствует чувство юмора, потому что у колонок отсутутвует опция остаточного объема и иногда вываливается мембрана. Есть и колонки с остаточным объемом и прочной мембраной, но они не подходят для стандартных пробирок от фирмы эппендорф, а пробирки, которые поставляются с колонками непригодны для автоклавирования, нестерильны и могут содержать РНКазы.

11. Я знаю человека, который выделяет РНК из пшеничной муки. Хорошую и качественную РНКу. Это лабораторный волшебник.

12. Я знаю человека, который выделяет РНК из отдельных клеток, причем количество РНК не фиксируется приборами. Тем не менее, он утверждает, что РНК в растворе присутствует. Это лабораторный шулер.

13. Я знаю лаборантку, которая выделяет всегда одинаковое количество хорошей РНКи из разных проб. При этом она не пользуется разовыми носиками для пипеток фабричной расфасовки. Это просто хорошая лаборантка.

14. Я знаю докторанта, который придерживается всех рекомендаций и ни разу не выделил хорошей РНКи. Причем я знаю много таких докторантов. Почти все докторанты такие. Они ходят со своими пробами к хорошей лаборантке.

15. Тем не менее, я люблю работать с РНК даже больше, чем с ДНК.

Comments

[giggster.livejournal.com]

не смотреть – во взглядє чілавєка содєржіцца невідімая нам енергія, до якої надзвичайно чутливі РНКази.

[progenes.livejournal.com]

да! і про память води не забудь.

[kot-kam.livejournal.com]

Боже, какое счастье, что я не пошел в биологи! Я б удавился!

[progenes.livejournal.com]

Понимаю. Но есть плюс - видно конечный результат, хотя зачастую и бессмысленный.

[giggster.livejournal.com]

я знаю одну молекулярщицю, яку хлібом не годуй, дай написати смішний пост, аби не виділят РНК.

[progenes.livejournal.com]

сволоч!

[kondybas.livejournal.com]

Про докторов понравилось :) У них вся сила на степень уходит, на собсно работу ничего не остается :)

[progenes.livejournal.com]

О да! Они способны менять свой жизненный график и время кофепития так, чтобы не пересекаться с коллегами. Таким образом они избегают главного вопроса: "Ну? Дописал уже диссер?".

[phyloxena.livejournal.com]

Где мои девятнадцать лет. У меня даже выделилось с первого раза! Больше не пробовала.

[progenes.livejournal.com]

У студентов всегда получается. Первый раз. Потом обычно перестает получаться.

[shao-s.livejournal.com]

Надо будет написать подобный набор мифов по patch-clamp. Ты текст о нём переводила - думаю, можешь представить, какой там простор для фантазии.

[progenes.livejournal.com]

еще бы! представляю! у нас тут по любому методу эпическая мифология существует. Отдельная тема - клонирование генов. Там каждый шаг пронизан оккультными признаниями и шаманскими практиками.

Замечательно.

[velta-1.livejournal.com]

Именно все так.

Я бы еще добавила, что после успешного (ура!) выделения РНК, ее (которая не нужна сейчас непосредственно в опыт) надо расфасовать по 1мкл и заморозить в кельвинаторе. При этом, когда придет нужда доставать аликвоты из кельвинатора - РНК будет содержаться в одной из 10 аликвот.

Re: Замечательно.

[progenes.livejournal.com]

Совершенно справделивое замечания. Есть еще тайное знание, что замораживание и размораживание РНК меняет концентрацию в растворе раз в 10.

Еще

[velta-1.livejournal.com]

можно написать аналогичное произведение про приготовление образцов для масс-спектрометрии.

Отклонения от правил и суеверий приводит к казусам, подобным описанному здесь: http://molbiol.ru/cb/01_01.html

Re: Еще

[progenes.livejournal.com]

оййй, курящая свинья это шедевр! Днями приходит ко мне докторант и спрашивает: вот я выудил из нашей коллекции EST ячменя все аминокислотные транспортеры, второй день медитирую на последовательности. Скажи мне, если я вижу один транспортер, который не похож ни на один из растительных, зато похож на 100% на грибной, то может это быть контаминацией? Это еще что, говорю, я здорово переполошилась, когда в коллекции гороховых генов обнаружила вполне себе человеческий HIV-induced фактор.

[ldoroshe.livejournal.com]

романтіка.

[progenes.livejournal.com]

хехе!

[plmnnk.livejournal.com]

а если серьезно - мне РНК в пятницу мерить (SAXS), точнее мое дело следить, чтоб бимлайн правильно работал, да данные обрабатывать, а мерить будет коллега-биолог. так она что-то никаких таких особых предосторожностей не предпринимает, носики берет из любой открытой коробки, пробирки в хатч заносит как попало. так как мерить я буду эти образцы далеко не первый раз (данные все время какие-то левые получаются), то у меня возникло подозрение, что что-то с РНКой идет наперекосяк.

я, конечно, поспрашивал биологов, да и коллега эта должна лучше меня знать, но все же: для любой РНКи все так плохо? у нее какая-то синтетическая РНК, сделанная некой фирмой Noxxon, что-то я не заметил, чтобы она придиралась к носикам или пробиркам (чтоб не из открытого пакета).
на что мне (не биологу) стоит обратить внимание?

[progenes.livejournal.com]

Я не берусь отсюда учить коллегу-биолога. Но суровая правда заключается не только в РНКазах. Даже в безРНКазной среде РНК валится при комнатной температуре, благодаря своей нестабильной химической структуре.

Но! Я просмотрела Noxxon. Они занимаются какими-то зеркальными мерами, которые очевидно комплементарно схлопываются, образуя шпильки. Они утверждают, что их синтетическая РНК стабильнее. Однако это не исключает аккуратности и предосторожностей в работе с РНКой: стерильные носики, эппики и холод.

[0lenka.livejournal.com]

Как это все жизненно :))) с РНКой не работала, но все равно смешно :)

[progenes.livejournal.com]

Надеюсь я отбила у тебя охоту

[tanchik.livejournal.com]

Хорошо, что я этого не видела перед своим первым в жизни выделением РНК. :) И так ручки дрожали, а зная все опасности, вообще б ничего путного не сделала. ;))

[progenes.livejournal.com]

А может я как раз напугать и хотела?!

[murrka.livejournal.com]

*провыделяв РНКу последние 7 лет* да-да-да! Все именно так!
Хотя и QIAдженовский кит, и тризол дают мне вполне симпатичные результаты, не надо гнать на каяджен, они хорошие, но дорогие сссс... волочи.

У меня, кстати, вопрос про РНКу созрел. Коли такая пьянка, я его даже задам. Выделяла я тут из tissue culture, с тарелочки, тотал, китом. Обычно при разгоне на агарозе видно два пухлых бенда и тооооненький посередке. Я так понимаю, что пухлые есть рибозомальная РНК. А вот что в этом тооооненьком? Потому что в одном из семплов у меня высветились два тоооненьких и пухлый посередке. Муха на результат не повлияла, но я уже неделю думаю - кто это? :)

[progenes.livejournal.com]

я что за tissue? вооще-то митохондриальная рибосомальная РНК с коэффициентом седиментации 24S. если растительная культура, то хлоропластная рибисомальная РНК визибл.

!!! klass fazy luny i chustvo umora!

[choana.livejournal.com]

Sogodni bula v labi pomityla novyj prikol----raspylitel' takyj yakym na kvity rospylyayut' vodychku----doverhu zapovnenyj RNase rozchyn-narod yak vydilyae rnku bruskae navkrug sebe vse sho bachyt' i prohodyashih ludej))
pro postdokov sho ne vmiyut' rnku norm vydilyaty ce ne pro nas u nas i postdoki i assistanty vyilyayut' prystojnu rnku vsi krim turka...a golovna nasha migera-kazala meni sho za svij vik vydidilyla bilsh nizh 5000 tyshsh sampliv i vsi majzhe chysti)
krepki nervy togo hto pobachyt'yak vypadae membrna v sample)))chustvo umora pry comu mabut' anglijske ))

Re: !!! klass fazy luny i chustvo umora!

[progenes.livejournal.com]

Такі прискалки я також бачила. А про мембрану, яка випадає, краще не питай. Страшна історія. По-перше, кручу 24 зразки. Швидкість проходження зразків через колонку нерівномірна, щохвилини відкриваю центрифугу і перевіряю на око, щоб там залишилось 10 мкл. Якщо пропущу момент, то РНК чіпляється на мембрану - фіг елюіруєш. Коли залишається 10 мкл (там, де залишилось). перевертається колонка догори ногами, і центрифугується. І тут ця грьобана мембрана випадає. Я намагаюсь змити з неї залишки, але де там. Всьо в мусорнік. Тут не почуття гумору треба, тут треба залізні нерви. Одне виправдовувало ці мічєнія, що те, що почистилось, те чистилось дійсно добре.

[vigna.livejournal.com]

Добавляю факт номер 16: существуют объекты, из которых РНК выделяется только и исключительно набором фирмы Х, причем не просто, а исключительно после добавления в лизирующий буфер раствора Y.
Стоит ли уточнять, что набор фирмы Х стоит тыщубаксов за 50 выделений, а раствор Y дешев, зато доходит до Москвы через три месяца после оплаты счёта...:(
Вероятность того, что вам попадется такой объект, обратно пропорциональна количеству денег в лаборатории.

[chieffa.livejournal.com]

О, а ты уже написала:) А то я не дочитав до конца выше историю изложил :)

[loogaroo.livejournal.com]

depc еще кто-то пользуется? во дают! мы салфеточками от рназов протираем стол и пипеторы. и все. а чтоб выделять как раз пользуемся колонками - никогда еще никаких мембран не вываливалось да и отдача отличная ))

[Михаил Соколов (from livejournal.com)]

Здравствуйте уважаемые корифеи и мастодонты! Обращаюсь с просьбой узнать Ваше мнение по-поводу 3-х вещей которые, надеюсь позволят мне избежать многих ошибок:
- насколько работает РНКазин, как ингибитор рнк-аз при получении ядерных комплексов рнк-протеин;
- стоит-ли заморачиваться с выделением ингибиторами рнк-аз из печени крыс или телят?
- Ваше мнение по составу, биологической активности и способу выделения в данном патенте http://www.freepatent.ru/patents/2422532

Прошу быть снисходительными, так как профессия врача к выделению суммарных ядерных рнк привела меня впервые в большей степени из-за избытка дорогого сырья - эмбриональных тканей поросят.
А опыт получения грубым щелочным гидролизом с очисткой ДНК переосаждением спиртом здесь вряд-ли пригодиться...
Буду благодарен любым коментам, нравиться здешний юмор опытных аналитиков, надеюсь на помощь
С уважением, Михаил.

mim999